凯氏定氮仪在水解肽的制备及抗氧化研究中的使

豆粕是大豆提取豆油后的副产品，蛋白质含量高 达 45 %以上，主要的蛋白质是沉降系数为 7S 与 11S 的球蛋白，其中大豆 11S 球蛋白含量占大豆蛋白总含 量的 40 %以上，对大豆蛋白的功能特性有着重要影响。

豆粕：佳木斯冬梅大豆食品有限公司；胰蛋白酶 （酶活力 1.0×105 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；三 氯乙酸、HCl、NaOH 等：北京化工厂。 FDU-2100 型冷冻干燥仪：日本 EYELA 公司； LXJ-IIB 型离心机：上海安亭仪器厂；pHS－2 型精密酸 度计：上海雷磁仪器厂；UV-1280 型紫外-可见分光光 度仪：日本岛津公司；KDN-103F 型凯氏定氮仪、HYP320 型消化炉：上海纤检仪器有限公司；HH-ZK1 型恒 温水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司。

大豆 11S 球蛋白的分离参照 Nagano 法，具体流 程如下： 豆粕→加水混合，料液比 1/10 （g/mL）→调节 pH7.5→提取 1 h→离心分离 10 000×g，15 min→取上 清液→添加亚硫酸钠 0.98 g/L→调节 pH6.4→4 ℃过 夜→离心分离 10 000×g，15 min→沉淀→冻干→大豆 11S 蛋白粗提物

大豆 11S 球蛋白溶液 （2 mg/mL）→95 ℃水浴 10 min→调节 pH 值→加胰蛋白酶水解→沸水浴 10 min 灭活→加三氯乙酸→离心→取上清液→抗氧化性检测

以水解度为指标在底物浓度为 2 mg/mL 的条件下 考察酶与底物比、pH 值、水解温度和水解时间对酶水 解大豆 11S 球蛋白水解度的影响。

在单因素试验基础上，以水解度为响应值，采用 Box-Behnken 试验设计方案进一步优化试验结果。

水解度测定采用三氯乙酸法（trichloroacetic acid， TCA），具体步骤如下： 准确量取 10 mL 酶解液，加入 10 mL10 %的三氯 乙酸溶液，震荡 10 min，5 000×g 离心 10 min，取上清 液，采用凯氏定氮法进行测定。 DH/%=（N2 - N1 ）（/ N0 - N1 ）×100 式中：N2 为大豆 11S 球蛋白酶解上清液中加 10 % TCA 后的可溶性氮，mg；N1 为水解前大豆 11S 球蛋白 上清液中加 10 % TCA 后的可溶性氮，mg；N0 为大豆 11S 球蛋白中含氮量，mg。

大豆 11S 球蛋白水解肽的超氧阴离子自由基 （O2 - ·）清除率的测定采用邻苯三酚法。大豆 11S 球蛋 白水解肽的羟自由基（·OH）清除率的测定采用罗丹明 B-Feton 体系光度法。

选取底物浓度 2 mg/mL，pH 值为 8.0，温度 50 ℃， 水解时间 3 h。研究 1 000、2 000、4 000、6 000、8 000、 10 000 U/g 的酶底比对水解度的影响，结果见图 1。

由于反应体系酶用量较少，本试验将胰蛋白酶配 制成一定浓度的酶液，加入反应体系。由图 1 可知，在 一定底物浓度下，水解度随酶与底物比的增加而呈上 升趋势，当酶与底物比达到 6 000 U/g 时，水解度最大， 继续增加酶与底物比，水解度基本不发生改变。这 是由于酶与底物已达到饱和，水解因而不再增加。因 此，本试验中酶水解大豆 11S 球蛋白的最佳酶底比 是 6 000 U/g。 2.1.2 pH 值对水解的影响 底物浓度 2 mg/mL，酶与底物比为 6 000 U/g，温度 50 ℃，水解时间 3 h，pH 值为 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 时对 水解度的影响，结果见图 2。

由图 2 可知，在 pH 值为 8 时，水解度达到最大 值。这是因为酶分子上活性基团只有在一定的解离状 态，才最适于与底物结合，pH 值高于或低于最适 pH值 时，活性基团的解离状态发生改变，酶和底物的结合 力降低，因而酶反应速率降低。因此，本试验中胰蛋白 酶水解大豆 11S 球蛋白的最佳酶解 pH 值为 8。 2.1.3 温度对水解的影响 底物浓度 2 mg/mL，酶与底物比为 6 000 U/g，pH 值 为 8.0，水解时间 3 h，研究温度为 30、40、50、60、70 ℃时 对水解度的影响，结果见图 3。

由图 3 可知，大豆 11S 球蛋白的水解度随着水解 温度的升高逐渐增大，当温度为 50 ℃时水解度最大， 继续升温，水解度反而呈现下降的趋势。这是由于随 着水解温度的升高，反应体系中底物与酶分子运动速 度加剧，增大了有效碰撞的几率，分子热运动的动能 增大，与活化能的能垒差减小，反应速度加快，但随着 温度的进一步升高而使酶逐步变性，即通过酶活力的 减少而降低酶的反应速度。因此，本试验中胰蛋白酶 水解大豆 11S 球蛋白的最适温度为 50 ℃。 2.1.4 水解时间对水解的影响 底物浓度 2 mg/mL，酶与底物比为 6 000 U/g，pH值 为 8.0，温度 50 ℃，以水解度为指标研究 1、2、3、4、5 h 的水解时间对水解度的影响，结果见图 4。

由图 4 可知，大豆 11S 球蛋白的水解度随着酶解 时间的增加而逐渐增大，反应时间在 3 h 之后，水解趋 于稳定，水解度增加不明显。这是由于随着反应的进 行，胰蛋白酶的作用位点逐渐变少，水解度变化不大。 因此，本试验中胰蛋白酶水解大豆 11S 球蛋白的最适 反应时间为 3 h。

大豆 11S 球蛋白中存在多个胰蛋白酶的专一性切 割位点，本研究通过胰蛋白酶专一识别赖氨酸和精氨 酸残基的肽链，获得多肽溶液，并研究对超氧阴离子 自由基（O2 - ·）和羟基自由基（·OH）的清除效果。以水 解度为指标考察，在底物浓度为 2 mg/mL 时，酶与底物 比、pH 值、温度和水解时间对胰蛋白酶水解大豆 11S 球蛋白单因素影响，在单因素试验的基础上，通过响 应面法研究了胰蛋白酶水解大豆 11S 球蛋白的水解条 件：当酶和底物比 4 900 U/g、pH 值 8.1、温度 44 ℃、水 解时间 2.6 h，大豆 11S 球蛋白水解度为 89.25 %。通过 对其抗氧化能力的测定表明，大豆肽溶液具有良好的 O2 - ·和·OH 的清除能力，清除率随着大豆肽添加量的 增加而提高。当肽液浓度为 12 mg/mL 时，对 O2 - ·的清 除率最高达到 46.86 %；当肽液浓度为 0.5 mg/mL 时对·OH 的清除率最高，达到 33.73 %